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转录因子Sp1对胆酸转运蛋白MRP3、MRP4表达的影响 被引量：3
1
作者 陈琨 柴进 +6 位作者 封欣婵 程英 张樑君 胡珍 陈兰芳 陈文生 何勇虹 《局解手术学杂志》 2016年第7期469-473,共5页
目的研究胆汁淤积时Sp1对MRP3、MRP4表达的影响,以完善MRP3、MRP4表达调控机制。方法构建Sp1过表达质粒及Sp1 siRNA片段,分别转染HepG2细胞,筛选稳转细胞株。提取细胞总RNA和总蛋白,RT-qPCR检测MRP3、MRP4 mRNA水平的变化,Western blot... 目的研究胆汁淤积时Sp1对MRP3、MRP4表达的影响,以完善MRP3、MRP4表达调控机制。方法构建Sp1过表达质粒及Sp1 siRNA片段,分别转染HepG2细胞,筛选稳转细胞株。提取细胞总RNA和总蛋白,RT-qPCR检测MRP3、MRP4 mRNA水平的变化,Western blot检测MRP3、MRP4蛋白水平的变化。结果成功构建了Sp1-OE-HepG2和Sp1siRNA-HepG2稳转细胞株。在Sp1-OE-HepG2细胞中,MRP3、MRP4 mRNA和蛋白水平表达均增高,其中MRP3 mRNA水平表达增高2.8倍,MRP3蛋白水平表达增高3.0倍;MRP4 mRNA和蛋白水平分别增高3.2倍和2.5倍;而在Sp1 siRNA-HepG2细胞中,MRP3、MRP4则表达下降,其中MRP3 mRNA表达降低52%,MRP4 mRNA表达降低58%,MRP3蛋白表达降低57%,MRP4蛋白表达降低60%。结论转录因子Sp1能够调控胆酸转运蛋白MRP3、MRP4的表达。 展开更多
关键词 胆汁淤积 转录因子 SP1 MRP3 MRP4
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Muc3羧基端内SEA组件的蛋白酶切与N糖基化关系的研究 被引量：1
2
作者 李宜成 何勇虹 +1 位作者 彭志红 汪荣泉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第21期2023-2026,共4页
目的Muc3的羧基端在翻译后经历了蛋白酶切反应,探讨Muc3的羧基端蛋白酶切反应发生是否与其羧基端内的N型糖链有关。方法截断了的Muc3的羧基端(含完整的SEA组件)(p20SEA)采用定点突变方法在所要求的位点插入终止密码子,所表达蛋白质的检... 目的Muc3的羧基端在翻译后经历了蛋白酶切反应,探讨Muc3的羧基端蛋白酶切反应发生是否与其羧基端内的N型糖链有关。方法截断了的Muc3的羧基端(含完整的SEA组件)(p20SEA)采用定点突变方法在所要求的位点插入终止密码子,所表达蛋白质的检测采用pulse/chase和免疫共沉淀方法或SDS/PAGE和Western印迹方法,所表达蛋白质的N型糖链合成抑制采用Tunicamycin处理转染的COS-1细胞。结果p20表达产物(完整的Muc3羧基端产物)经历了翻译后蛋白酶切,产生30×103的氨基端酶切片段和49×103的羧基端酶切片段;Tunicamycin处理后主要的表达蛋白是60×103的全长的非糖基化产物,22×103的少量氨基端酶切片段和41×103的羧基端酶切片段;p20SEA表达产物(含完整的SEA组件但不含SEA组件后续氨基酸的截断Muc3羧基端)抑制N型糖链出现未酶切的36×103全长产物和22×103酶切的非N糖基化产物。结论大鼠Muc3羧基端在抑制其N型糖链合成后出现Muc3的羧基端蛋白酶切的抑制。 展开更多
关键词 黏蛋白3 蛋白酶切 SEA组件 糖基化
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黏蛋白3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制对其细胞膜定位的影响
3
作者 何勇虹 李宜成 +1 位作者 彭志红 汪荣泉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期823-825,共3页
目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1... 目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1细胞,抑制其表达蛋白质的N型糖链合成。采用免疫荧光定位法,用抗V5抗体和抗Myc抗体检测Muc3蛋白的表达。结果在甲醇固定的COS-1细胞,细胞核周和细胞表面均能检测到完整的Muc3羧基端p20表达产物;在未经甲醇固定的COS-1细胞,免疫荧光仅限于细胞表面。缺失的rMuc3羧基端的p20t表达产物仅能在细胞核周检测到。Muc3羧基端建立的蛋白酶切阴性突变体p20s/a与p20转染细胞的荧光分布相近。衣霉素抑制糖链合成后不影响膜定位。结论Muc3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制不能影响Muc3的细胞膜定位,影响其定位的因素主要是SEA组件靠近羧基端的区域,包括该分子的跨膜区和胞质内区域。 展开更多
关键词 黏蛋白类 蛋白酶切 糖基化
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大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序对其蛋白酶切的影响
4
作者 李宜成 何勇虹 +1 位作者 彭志红 汪荣泉 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期382-385,共4页
目的探讨大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的影响。方法采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证。然后通过Western Blot检测各突变体的表达,并分析未酶切部... 目的探讨大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的影响。方法采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证。然后通过Western Blot检测各突变体的表达,并分析未酶切部分所占比例。结果细胞裂解物经Western Blot免疫印迹实验,证实在55kd处存在未酶切的部分,在30kd处存在可被抗V5抗体检测的N端部分,经过Quantity one分析后发现,S2/A完全抑制了酶切的发生,G/A抑制了绝大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/AI、/A、V1/A、V2/A均对酶切产生了不同程度的抑制,未酶切部分分别为22%、39%、14%和17%,而K/A和S2/A几乎对酶切没有影响,其未酶切部分分别为6%和3%,酶切效率与p20(未酶切部分占4%)几乎一样。结论酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的,其机制可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区,其上的氨基酸对于维持黏蛋白的构象是必须的。在S1上可能有O型糖链的存在,并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS1KGS2IV1V2的酶切。 展开更多
关键词 黏蛋白rMuc3 酶切 基序 定点突变 转染 SEA组件
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SEA组件174-201位氨基酸对大鼠黏蛋白rMuc3羧基端酶切的影响
5
作者 彭志红 何勇虹 +4 位作者 唐波 李宜成 陈文生 房殿春 汪荣泉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1315-1317,1320,共4页
目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端SEA组件内174-201位氨基酸对LSKGSIVV基序酶切的影响。方法采用ClustalX1.83软件对包含SEA组件的蛋白质进行比对,选择SEA组件后续79个氨基酸中保守的氨基酸残基,利用定点突变技术将这些保守残基突变为... 目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端SEA组件内174-201位氨基酸对LSKGSIVV基序酶切的影响。方法采用ClustalX1.83软件对包含SEA组件的蛋白质进行比对,选择SEA组件后续79个氨基酸中保守的氨基酸残基,利用定点突变技术将这些保守残基突变为终止密码子,分别命名为p20t1、p20t2、p20t3、p20t4,并测序验证。将不同长度的突变体转染COS-7细胞,用N-端V5标签抗体行Western blotting,检测各突变体的酶切情况。结果rMuc3羧基端第174位丝氨酸(S)、第201位半胱氨酸(C)、第212位酪氨酸(Y)、第223位酪氨酸(Y)在多种含SEA组件的蛋白质中非常保守。Western blotting检测结果表明,含rMuc3羧基端的p20及突变体p20t2、p20t3、p20t4的表达产物在LSKGSIVV基序处均能发生酶切,均可检测到30kD的酶切后片段,但p20t1的表达产物在LSKGSIVV位点处不能发生蛋白酶切。结论rMuc3羧基端第174位S至第201位C残基对LSKGSIVV基序酶切的发生至关重要,是SEA组件在LSKGSIVV基序发生蛋白酶切的另一必要条件。 展开更多
关键词 黏蛋白类 SEA组件 突变
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rTFF3、rIgGFcBp和rMuc2在大鼠肠道黏液层中的分布
6
作者 余灏 张新 +6 位作者 彭志红 何勇虹 朱蓉 杨永涛 柏建鹰 陈文生 汪荣泉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期289-292,共4页
目的探索3种杯状细胞来源分子rTFF3、rMuc2和rIgGFcBp在结肠黏液层中的分布特点。方法雄性SD大鼠5只,采用Carnoy固定液固定结肠黏膜,AB-PAS染色验证不同黏液层的组织结构。通过轻吸、轻刮分别收集疏松层、致密层黏液和底层黏膜标本,加... 目的探索3种杯状细胞来源分子rTFF3、rMuc2和rIgGFcBp在结肠黏液层中的分布特点。方法雄性SD大鼠5只,采用Carnoy固定液固定结肠黏膜,AB-PAS染色验证不同黏液层的组织结构。通过轻吸、轻刮分别收集疏松层、致密层黏液和底层黏膜标本,加入不含DTT的2×SDS-PAGE上样缓冲液沸水浴提取全部蛋白。冷却至室温后,统一可溶性蛋白提取液体积,将不同黏液层等份样品进行还原或非还原SDS-PAGE,并对rTFF3、rMuc2和rIgGFcBp进行蛋白质印迹分析。结果两层肠道黏液均含rTFF3的250kD复合物和6kD单体,以疏松层明显;在疏松层和致密层黏液中未检测到55kD复合物。rIgGFcBp连续分布于黏液层,在非还原情况下,其分子量为214kD以上;在还原情况下,其分子量分别为258kD、214kD和140kD。rMuc2的分布模式与rIgGFcBp相似,以214kD以上的多聚体分布于黏液层,还原后转变为278kD和164kD的亚单位。结论rTFF3以单体和复合物的形式分布于疏松层和致密层黏液,其复合物可能与黏液的结构和功能相关;rIgGFcBp、rMuc2均以复合物形式分布于黏膜全层,推测两者均为黏液的结构性成分。 展开更多
关键词 rTFF3 基因 rMuc2 基因 rIgGFcBp 基因 黏蛋白类 黏液
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