目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建...目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建克隆的正确性,然后将重组质粒转化进大肠杆菌BL21a(DE3)中,并在大肠杆菌BL21a(DE3)中大规模诱导表达NP蛋白,使用AKTA纯化系统经强阳离子交换层析纯化出NP蛋白。结果测序和小量诱导结果表明,扩增的NP蛋白片段序列正确,所构建的p ET-22b+-NP克隆可在大肠杆菌BL21a(DE3)的包涵体和细胞质中表达;通过阳离子交换层析和浓缩后,蛋白的纯度和浓度都得到明显提高。结论纯化出高纯度、高浓度的NP蛋白,为NP蛋白功能性研究提供重要基础。展开更多
目的利用稳定表达线粒体荧光信号的细胞系,检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)对有丝分裂时期细胞的线粒体形态及分布的影响。方法构建表达线粒体荧光信号的病毒表达载体,经测序鉴定和Western印迹检测正确后,通过病毒包装及感染...目的利用稳定表达线粒体荧光信号的细胞系,检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)对有丝分裂时期细胞的线粒体形态及分布的影响。方法构建表达线粒体荧光信号的病毒表达载体,经测序鉴定和Western印迹检测正确后,通过病毒包装及感染的方法构建稳定表达线粒体荧光信号的He La s3细胞系He La s3-COX4tp-EGFP;进一步用免疫荧光法观察线粒体在ROS影响下形态及分布的变化。结果成功构建表达线粒体荧光信号的病毒表达载体及稳定细胞系,通过激光共聚焦显微镜观察,发现H2O2处理能显著影响有丝分裂时期细胞线粒体的形态及分布。结论初步证明ROS可影响线粒体有丝分裂时期的形态及分布,为后续研究线粒体功能与细胞有丝分裂的调控奠定基础。展开更多
文摘目的利用稳定表达线粒体荧光信号的细胞系,检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)对有丝分裂时期细胞的线粒体形态及分布的影响。方法构建表达线粒体荧光信号的病毒表达载体,经测序鉴定和Western印迹检测正确后,通过病毒包装及感染的方法构建稳定表达线粒体荧光信号的He La s3细胞系He La s3-COX4tp-EGFP;进一步用免疫荧光法观察线粒体在ROS影响下形态及分布的变化。结果成功构建表达线粒体荧光信号的病毒表达载体及稳定细胞系,通过激光共聚焦显微镜观察,发现H2O2处理能显著影响有丝分裂时期细胞线粒体的形态及分布。结论初步证明ROS可影响线粒体有丝分裂时期的形态及分布,为后续研究线粒体功能与细胞有丝分裂的调控奠定基础。
