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1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定 被引量：4
1
作者 付嘉钰 陈汭 +5 位作者 黄小波 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1847-1856,共10页
【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在... 【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在病原诊断方面具有重要意义。【目的】以纯化的重组PDCo VN蛋白为抗原,制备抗N蛋白的单克隆抗体并进行特性鉴定。【方法】利用已构建的p ET-28a-N表达菌,经IPTG诱导表达获得具有免疫原性的重组N蛋白,并将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,经3次亚克隆筛选,选取抗体效价最高的一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔并制备腹水单克隆抗体,利用Protein G亲和层析柱纯化。通过腹水单克隆抗体效价测定、抗体亚型鉴定、Western blot鉴定其特性;利用细胞间接免疫荧光试验、组织石蜡切片荧光试验、免疫组化、流式细胞荧光分选技术鉴定其诊断应用价值。【结果】经筛选后得到一株杂交瘤细胞命名为4E88,其腹水单克隆抗体效价为1:105,亚型为Ig G1型,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体与重组N蛋白和超速离心纯化的PDCo V全病毒反应形成特异性条带。此外,单克隆抗体4E88可以用于猪δ冠状病毒检测的间接免疫荧光试验、免疫组化染色和流式细胞荧光分选技术。【结论】研究获得的单克隆抗体4E88具有较好的反应性,为后续开展PDCo V鉴定、诊断和N蛋白功能研究等奠定基础。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体 制备 鉴定 应用
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不同动物源性细胞系对猪丁型冠状病毒的易感性 被引量：4
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作者 瞿欢 胡靖飞 +12 位作者 李施倩 肖黛 张路文 付嘉钰 赵玉佳 陈汭 文翼平 伍锐 赵勤 颜其贵 文心田 曹三杰 黄小波 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期672-685,共14页
【目的】探究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)能否在不同动物源性细胞系中感染和增殖。【方法】本研究将PDCoV四川分离株CHN-SC2015接种来自仓鼠、家禽、猴、人和猪的12种细胞系,将病毒在每种细胞系中盲传至少5代并通... 【目的】探究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)能否在不同动物源性细胞系中感染和增殖。【方法】本研究将PDCoV四川分离株CHN-SC2015接种来自仓鼠、家禽、猴、人和猪的12种细胞系,将病毒在每种细胞系中盲传至少5代并通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、间接免疫荧光试验(IFA)和测序鉴定。【结果】PDCoV在Vero、PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞中的P1表现出明显的细胞病变效应(CPE),且在PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞上有不同程度的增殖,但在Vero和PAM细胞的后续传代中CPE逐渐消失;除3种易感细胞外(PK15、LLC-PK1和ST),病毒拷贝数随着传代次数的增加而逐渐降低,而在DEF、Marc-145、HEK-293、ZYM-SIEC02和PAM细胞的P4或P5中不能检测到PDCoV;PCR结果显示,只有在CEF和Vero细胞的P5中还能检测到PDCoV;IFA的结果表明,PDCoV可以感染除BHK-21和ZYM-SIEC02以外的大多数细胞,在PK15、LLC-PK1和ST细胞的P1、P3和P9均可以观察到特异性免疫荧光,因此仅3种细胞系(PK15、LLC-PK1和ST)适合病毒的连续传代,在P9病毒滴度分别可达10^(7.11)、10^(7.00)和10^(7.37) TCID_(50)/mL;在不同的细胞系中传代后,PDCoV的S基因序列累计有14个核苷酸和相应的12个氨基酸突变。【结论】本研究表明,PDCoV可在体外感染多种细胞,提示其可能存在跨种传播潜力。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 细胞系 易感性 感染 跨物种传播
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猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3
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作者 陈汭 付嘉钰 +10 位作者 刘浩宇 李成 赵玉佳 胡靖飞 瞿欢 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 黄小波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期104-110,共7页
旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Wester... 旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体
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