目的构建携带野生型PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PTEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PTEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTra...目的构建携带野生型PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PTEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PTEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Westernblot检测靶细胞内PTEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PTEN基因的腺病毒载体。展开更多
文摘目的构建携带野生型PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PTEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PTEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Westernblot检测靶细胞内PTEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PTEN基因的腺病毒载体。