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卵泡抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒的构建及表达 被引量：28
1
作者 茆达干 杨利国 +2 位作者 曹少先 张志杰 何晓红 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期775-778,共4页
目的 :构建高免疫原性的抑制素真核表达载体。方法 :通过PCR扩增pCMV S基因中的S基因片段 ,然后将抑制素α(1 32 )片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒pcDNA13.1( ) :酶切、测序鉴定后 ,采用脂质体包裹法将重组质粒转染Hela细胞 ,用SDS... 目的 :构建高免疫原性的抑制素真核表达载体。方法 :通过PCR扩增pCMV S基因中的S基因片段 ,然后将抑制素α(1 32 )片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒pcDNA13.1( ) :酶切、测序鉴定后 ,采用脂质体包裹法将重组质粒转染Hela细胞 ,用SDS PAGE和ELISA对其表达产物进行检测。用抑制素融合表达质粒免疫大白鼠 ,ELISA检测血中抗抑制素抗体水平。结果 :酶切鉴定和序列分析表明 ,融合基因的表达质粒pClS构建成功。表达质粒在HeLa细胞中获得了表达 ,融合蛋白的分子量约为 2 9kD ,融合蛋白具有抑制素免疫原性。重组质粒免疫使大白鼠产生了抗抑制素抗体。结论 :高免疫原性的抑制素表达质粒的构建为利用抑制素基因免疫技术诱导单胎动物生多胎奠定了基础。 展开更多
关键词 卵泡抑制素 乙肝表面抗原 基因克隆 基因表达 表达质粒 真核表达载体
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鸡IL-18真核表达载体的构建及其对新城疫疫苗免疫增强作用的研究 被引量：20
2
作者 程相朝 赵德明 +2 位作者 吴庭才 李银聚 张春杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期476-481,共6页
利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所... 利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所产生的HI抗体效价和T、B淋巴细胞增殖反应均高于单纯疫苗免疫组及pcDNA3 空白质粒和疫苗联合免疫组。其中,HI抗体效价在15 d 时差异显著(P<0 05),在30 和35 d时差异极显著(P<0 01); T淋巴细胞增殖反应在15 d后均表现为差异显著(P<0 05〉或极显著(P<0 01);而单纯疫苗组与空白质粒和疫苗联合免疫组之间的各测定指标则无明显的差异(P>0 05)。在35 d时进行攻毒, pcDNA3 IL18和疫苗联合免疫组的保护率为83.3%,而单纯疫苗免疫组、空白质粒和疫苗联合免疫组鸡的保护率则分别只有61.5%和66.7%。说明该pcDNA3 IL18真核表达质粒在鸡体内得到了表达,表达产物不仅能够显著增强新城疫疫苗所诱导的细胞免疫和体液免疫反应,而且还可以明显提高疫苗的保护率。 展开更多
关键词 免疫增强作用 真核表达载体 新城疫疫苗 IL-18 构建 HI抗体效价 联合免疫 真核表达质粒 体液免疫反应 疫苗免疫 增殖反应 差异显著 B淋巴细胞 T淋巴细胞 保护率 疫苗接种 鸡新城疫 测定指标 细胞免疫 表达产物 全基因 脾细胞
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猪2型圆环病毒核酸疫苗的接种Balb/c小鼠实验免疫研究 被引量：14
3
作者 金宁一 秦晓冰 +4 位作者 郑敏 鲁会军 张洪勇 尹革芬 葛淑敏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期76-79,共4页
为了筛选得到较理想的核酸疫苗,用pVAX1真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和与复制相关蛋白基因为目的基因,构建了4个重组质粒,分别是pVAX1-ORF2、pVAX1-UL18ORF2、pVAX1-ORF2ORF1和pVAX1-IL18ORF2ORF1。... 为了筛选得到较理想的核酸疫苗,用pVAX1真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和与复制相关蛋白基因为目的基因,构建了4个重组质粒,分别是pVAX1-ORF2、pVAX1-UL18ORF2、pVAX1-ORF2ORF1和pVAX1-IL18ORF2ORF1。用它们免疫6-8周龄Balb/c小鼠,进小鼠后一周首免,每隔19d免1次,共免3次;每10d采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。统计学分析发现:4个核酸疫苗实验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清中,获得最高的抗体效价,与对照组PBS和空载体pVAX1相比都能产生一定的体液免疫反应,且以pVAx1-IL18ORF2ORF1核酸疫苗免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫实验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P<0.05),并以pVAX-1-IL18ORF2ORF1数值较高。结论是核酸疫苗pVAX1-IL18ORF2ORF1既能较好地刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫反应,相对较好,将作为候选核酸疫苗进行下一步本体动物免疫实验研究。 展开更多
关键词 BALB/C小鼠 猪2型圆环病毒 核酸疫苗 免疫研究 血清抗体效价 淋巴细胞亚类 体液免疫反应 ELISA方法 接种 真核表达载体 流式细胞仪 统计学分析 目的基因 蛋白基因 衣壳蛋白 重组质粒 免疫小鼠 数量测定 免疫实验 细胞免疫
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IL-12及HBV基因疫苗共同免疫小鼠的效果 被引量：20
4
作者 杜德伟 周永兴 +2 位作者 冯志华 姚志强 李光玉 《世界华人消化杂志》 CAS 2000年第2期128-130,共3页
目的 观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响。 方法 肌肉注射DNA疫苗,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h ^(51)Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。 结果 免疫8wk后,注射pCR3.1组、注射pCR3.1-S组及共注... 目的 观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响。 方法 肌肉注射DNA疫苗,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h ^(51)Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。 结果 免疫8wk后,注射pCR3.1组、注射pCR3.1-S组及共注射IL-12真核表达载体的血清A(OD值)分别为0.04±0.01,0.87±0.1及1.67±0.15。CTL细胞杀伤活性分别为10.1％±6.4％,50.5％±6.4％及73.3％±8.8％,后两组与pCR3.1组比较均有显著差异(P<0.01),后两组比较均有显著差异(P<0.01).脾细胞悬液经抗CD4^+单克隆抗体处理后分别为48.3％±5.9％,75.6％±9.1％,抗CD8^+单克隆抗体处理后分别为10.6％±1.4％,16.9％±2.3％。 结论 IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,CTL细胞杀伤活性主要由CD8^+执行。基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染。 展开更多
关键词 基因疫苗 真核表达载体 IL-12 乙型肝炎病毒
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人增殖抑制基因(HSG)对肿瘤细胞系化疗敏感性的作用 被引量：15
5
作者 王萍 毋丽娜 +4 位作者 蒋春笋 李志新 张颖妹 陈光慧 邱晓彦 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期117-120,共4页
目的:将人增殖抑制基因 (hHSG)用电子穿孔的转基因方式转染到体外培养的人肿瘤细胞系中,观察hHSG基因对内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系的化疗敏感性的影响。方法:首先用免疫组化方法检测不同组织来源的肿瘤细胞系中hHSG的表达水平... 目的:将人增殖抑制基因 (hHSG)用电子穿孔的转基因方式转染到体外培养的人肿瘤细胞系中,观察hHSG基因对内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系的化疗敏感性的影响。方法:首先用免疫组化方法检测不同组织来源的肿瘤细胞系中hHSG的表达水平,然后选择内源性hHSG表达水平较低的肺腺癌 (A549 )和内源性hHSG表达水平较高的宫颈癌(HeLaS3)细胞系,用电穿孔方法转染含有hHSG的真核表达载体 (pEGFP hHSG) 24h后,加入放线菌酮(CHX),采用细胞计数、MTT法观察hHSG对肿瘤细胞增殖抑制作用及对CHX的化疗敏感性的影响。结果:hHSG在不同组织来源的肿瘤细胞系都有不同程度的表达, pEGFP hHSG转染到两种内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系后,这两种肿瘤细胞的生长增殖都明显受到抑制,同时外源性的hHSG也增强了这些肿瘤细胞系对CHX的敏感性。结论:外源性hHSG可不依赖其内源性表达水平而抑制肿瘤细胞的增殖,与CHX并用可增强肿瘤细胞对CHX的敏感性,具有协同作用。 展开更多
关键词 化疗敏感性 抑制基因 人肿瘤细胞系 免疫组化方法 真核表达载体 增殖抑制作用 抑制肿瘤细胞 组织来源 内源性 CHX 体外培养 基因方式 放线菌酮 细胞计数 MTT法 不同程度 生长增殖 协同作用 外源性 水平 转染 G基因 HHS
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鸡IL-18真核表达载体的构建及其对IBD灭活疫苗免疫增强作用的研究 被引量：11
6
作者 张春杰 程相朝 +2 位作者 李银聚 吴庭才 赵德明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期617-621,共5页
目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B... 目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA增殖反应的观察 ,研究了其对IBD胚毒灭活疫苗的免疫增强效果。结果 :同时接种IBD灭活疫苗和IL 18真核表达质粒的免疫鸡所产生的中和抗体效价在接种第 2 8天后明显高于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;其T、B淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组 ,尤其是T淋巴细胞的增殖反应从接种后第 2 1天开始即明显强于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;接种后第 4 2天时进行的攻毒试验结果表明 ,同时接种IL 18表达质粒的试验组鸡获得 93 3%的保护 ,而单纯疫苗接种组的保护率只有 86 7%。结论 :鸡IL 18真核表达质粒在鸡体内得到了良好表达 ,表达产物不但具有明显的增强IBD灭活疫苗诱导细胞免疫的作用 ;同时 ,对于中和抗体水平的提高、B淋巴细胞增殖反应的加强也具有明显的作用。科技大学禽病研究室应用IBDV地方野毒株 (L0 15和L0 17株 )所制备的胚毒灭活油乳苗。1 1 2　实验用鸡　为洛阳市新安县机械化鸡场提供的 1日龄健康罗曼雏公鸡 ,自饲养至所需日龄。1 1 展开更多
关键词 鸡 IL-18 真核表达载体 免疫增强作用
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RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响 被引量：9
7
作者 田余祥 于秀萍 +1 位作者 王冬梅 崔秀云 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 2001年第6期481-484,共4页
目的 :通过构建核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor ,RI)基因的真核表达载体———pLNCX ri,并转染C6神经胶质瘤细胞 ,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制。方法 :用NdeI Xho从已构建的 pET ri上切下1.4kb的RI基因片段 ,再构建到 pL... 目的 :通过构建核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor ,RI)基因的真核表达载体———pLNCX ri,并转染C6神经胶质瘤细胞 ,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制。方法 :用NdeI Xho从已构建的 pET ri上切下1.4kb的RI基因片段 ,再构建到 pLNCX上 ,获得真核表达载体 (pLNCX ri) ,采用LipofectAMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞 ,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆 ,用Westernblotting检测RI基因的表达水平。将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下 ,观察肿瘤的生长情况。结果 :在转染的C6神经胶质瘤细胞中 ,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞 ,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期 2 3±5 7天 (对照组 14± 3 5天 ) ,瘤组织重量 :转染组 1 35± 0 4 3g比对照组 2 4 0± 0 6 1g(P <0 0 1)明显下降 ,瘤组织的血管密度 :转染组 2 7 2± 4 31比对照组 47± 6 5 4(P <0 0 1)明显减少。结论 :RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用 ,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成。 展开更多
关键词 核糖核酸酶抑制因子基因 基因转染 神经胶质瘤 C6细胞 RI基因 真核表达载体
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DT/VEGF系统对胃癌细胞的杀伤效应 被引量：16
8
作者 潘欣 柯重伟 +3 位作者 潘卫 贺祥 曹广文 戚中田 《世界华人消化杂志》 CAS 2000年第4期393-396,共4页
目的 研究ＤＴ３９０基因与ＶＥＧＦ人外显子７基因晤后对胃癌细胞的杀伤作用，探索毒素晤基因治疗胃癌的有效途径，方法 构建携带ＤＴ９０－ＶＥＧＦ１６５或ＤＴ３９０－ＶＥＧＦｅｘｏｎ７融合基因的真核表达载体，用脂质体介导转... 目的 研究ＤＴ３９０基因与ＶＥＧＦ人外显子７基因晤后对胃癌细胞的杀伤作用，探索毒素晤基因治疗胃癌的有效途径，方法 构建携带ＤＴ９０－ＶＥＧＦ１６５或ＤＴ３９０－ＶＥＧＦｅｘｏｎ７融合基因的真核表达载体，用脂质体介导转染胃癌细胞ＳＧＣ７９０１，观察胃癌细胞的形态变化，结果 ５μｇ趑 核表达构的转染５×１０＾５个胃癌细胞／孔（２４孔板）９６ｈ后发现，转素融合基因的细胞９０％死亡，而对照细胞形态正常。 展开更多
关键词 真核表达载体 胃肿瘤 基因治疗 VEGF
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IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达 被引量：8
9
作者 刘毅 金宁一 +5 位作者 古长庆 罗坤 方厚华 王宏伟 李萍 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期321-323,共3页
将传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) VP2 /VP2 4 3插入真核表达载体 pc DNA中 ,置于 CMV启动子的调控之下 ,构建成 DNA疫苗表达质粒 pc DNA VP2和 pc DNA VP0。分别转染 CEF细胞后 ,于 2 4、4 8、72 h取细胞裂解液进行 ELISA、SDS-PAGE和 Wes... 将传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) VP2 /VP2 4 3插入真核表达载体 pc DNA中 ,置于 CMV启动子的调控之下 ,构建成 DNA疫苗表达质粒 pc DNA VP2和 pc DNA VP0。分别转染 CEF细胞后 ,于 2 4、4 8、72 h取细胞裂解液进行 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot检测 ,pc DNA VP2于转染后 2 4 h呈阳性反应 ,4 8h表达量高于 2 4 h;pc DNA VP0于转染后 4 8h呈阳性反应 ,72 h表达量高于 4 展开更多
关键词 DNA疫苗 真核表达载体 传染性法氏囊病病毒
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基于SemlikiForest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗的初步研究 被引量：11
10
作者 李娜 仇华吉 +4 位作者 李国新 朱庆虎 罗玉子 贾洪林 童光志 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期53-58,共6页
将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测... 将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。 展开更多
关键词 Semliki Forest病毒 RNA复制子 猪瘟 RNA疫苗 猪瘟病毒 真核表达载体
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ING4基因真核表达载体的构建及其功能 被引量：12
11
作者 王金志 缪竞诚 +1 位作者 盛伟华 杨吉成 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期383-386,F0002,共5页
目的:构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法:小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING... 目的:构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法:小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约750 bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率(23.66%)明显高于对照组(13.75%)。结论:成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。 展开更多
关键词 ING4基因 真核表达载体 基因构建 基因功能 细胞凋亡 肝癌
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羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性 被引量：14
12
作者 陈轶霞 才学鹏 +10 位作者 景志忠 丁军涛 王颖 蒙学莲 张燕 贾万忠 乔军 闫鸿斌 房永祥 陈国华 骆学农 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期133-137,共5页
通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法... 通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。 展开更多
关键词 羊痘病毒 P32基因 真核表达载体 表达 免疫原性
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结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建 被引量：11
13
作者 范雄林 徐志凯 +3 位作者 白光春 李元 李别虎 薛莹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期314-316,共3页
目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,... 目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实 ,与Erdman株完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B 真核表达载体 基因克隆
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猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性 被引量：15
14
作者 向敏 张洁 +10 位作者 高其双 卢顺 陈志华 黄海军 陶弼菲 彭霞 占才耀 夏瑜 童伟文 华娟 王连芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1627-1630,共4页
用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因(COE基因),通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体pIRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和Western blot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BAL... 用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因(COE基因),通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体pIRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和Western blot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB/c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP-COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 真核表达载体 转染 免疫原性
原文传递
口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达 被引量：7
15
作者 尤永进 葛艳 +5 位作者 陈波 饶忠 徐泉兴 朱彩珠 张强 卢永干 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期168-171,共4页
设计、合成FMDV非结构蛋白 3B基因的PCR引物 ,并在引物 5’端和 3’端分别加入含BamHI和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组RNA为模板 ,利用RT_PCR技术扩增 3B基因 ,得到的基因片段经BamHI/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBACHTa连... 设计、合成FMDV非结构蛋白 3B基因的PCR引物 ,并在引物 5’端和 3’端分别加入含BamHI和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组RNA为模板 ,利用RT_PCR技术扩增 3B基因 ,得到的基因片段经BamHI/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBACHTa连接 ,转化宿主菌DH10BAC ,在含庆大霉素、卡那霉素、X_gal、IPTG的LB平板上 37℃培养 2 4h ,提取白色菌落 ,从中提取重组穿梭载体Bacmid 3B ,与脂质体共同转染昆虫细胞sf9,得到重组杆状病毒 ,病毒经传代扩增后感染High 5细胞 ,表达目的蛋白———FMDV非结构蛋白 3B。SDS_PAGE及WesternBlot结果显示 ,本研究成功构建了Bacmid_3B重组表达载体 ,并在昆虫细胞中表达了NSP_3B蛋白 ,该表达产物可与FMDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白 真核表达载体 克隆 表达
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RNA干扰真核表达载体pEGFP-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究 被引量：10
16
作者 姜晓兵 赵洪洋 +3 位作者 周凤 刘如恩 张方成 赵甲山 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期547-550,共4页
目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介... 目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pEGFP- H1和pEGFP- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pEGFP- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pEGFP -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pEGFP- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论　pEGFP H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。 展开更多
关键词 VEGF EGFP 血管内皮生长因子 肿瘤 介导 治疗 真核表达载体 U251细胞 RNA干扰 短发夹环RNA
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MDR1基因短发卡样RNA表达载体逆转K562/A02人白血病细胞多药耐药的研究 被引量：9
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作者 肖希斌 谢兆霞 秦群 《中华肿瘤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期422-425,共4页
目的构建MDR1基因短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,观察对K562/A02人白血病细胞株MDR1基因的沉默作用以及对P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响。方法以基因重组技术构建表达质粒,转染重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B至K56... 目的构建MDR1基因短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,观察对K562/A02人白血病细胞株MDR1基因的沉默作用以及对P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响。方法以基因重组技术构建表达质粒,转染重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B至K562/A02细胞株,通过半定量RT-PCR和蛋白质印迹法,检测MDR1基因表达及P-gp表达水平的变化；以MTT法检测阿霉素(ADM)对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50))；高效液相色谱(HPLC)法检测细胞内ADM含量。结果构建的2种重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B均明显抑制K562/A02细胞株MDR1基因表达,抑制率最高为48．2%±2．5%；同时抑制P-gp蛋白的表达,抑制率最高为50．67%。对ADM药物敏感性的相对逆转效率分别为40．8%和62．4%；同时使K562/ A02细胞内ADM含量增加。结论shRNA表达载体可明显抑制K562/A02细胞MDR1 mRNA的转录和P-gp蛋白的表达,增加K562/A02细胞内ADM含量,恢复K562/A02细胞对化疗药物的敏感性,逆转MDR1基因编码蛋白P-gp介导的多药耐药。 展开更多
关键词 MDR1基因 真核表达载体 K562/A02人白血病细胞株 P-糖蛋白 多药耐药
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家蝇抗菌肽Cecropin-His_6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建 被引量：12
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作者 徐建华 朱家勇 +1 位作者 金小宝 许琴英 《生物技术》 CAS CSCD 2005年第1期3-7,共5页
克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行... 克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行序列测定 ;然后用含 6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin -His 6融合基因 ,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1(+)中 ;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明 ,RT -PCR扩增得到约 2 30bp的目的cDNA片段 ,与Genebank中报道的家蝇CecropincDNA序列存在一个无义变异差异 (Lys:AAG→AAA) ;6×His标签成功融合到Cecropin的C端。Cecropin -His 6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。 展开更多
关键词 家蝇 抗菌肽 基因克隆 生物信息学分析 真核表达载体
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促胃液素对结肠癌细胞侵袭力的影响 被引量：10
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作者 丁健 于皆平 +3 位作者 李丹 于红刚 罗和生 魏文洲 《中华肿瘤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期213-215,共3页
目的　研究促胃液素对人结肠癌细胞侵袭力的影响,以及促胃液素 促胃液素受体黏着斑激酶(FAK)信号通路在此过程中的作用。方法　使用促胃液素受体的真核表达载体pCR3.1 /GR转染人结肠癌细胞株Colo32 0 (Colo32 0 /GR) ,使其高表达促胃液... 目的　研究促胃液素对人结肠癌细胞侵袭力的影响,以及促胃液素 促胃液素受体黏着斑激酶(FAK)信号通路在此过程中的作用。方法　使用促胃液素受体的真核表达载体pCR3.1 /GR转染人结肠癌细胞株Colo32 0 (Colo32 0 /GR) ,使其高表达促胃液素受体,达到上调信号通路的作用;使用反义寡核苷酸阻断FAK的表达,达到下调信号通路的作用。使用递增剂量的促胃液素(0 ,0 .1 ,1 ,1 0 ,1 0 0nmol/L)刺激Colo32 0和Colo32 0 /GR细胞,用Boyden小室检测各组细胞侵袭力变化;使用免疫沉淀和蛋白质印迹法,检测细胞FAK第397位酪氨酸(tyr -397)磷酸化的状况。使用免疫沉淀、蛋白质印迹法和Boyden小室法检测正常细胞、Colo32 0 /GR、转染反义寡核苷酸组细胞和对照组细胞在接受促胃液素刺激前后,细胞侵袭力和FAKtyr 397磷酸化的变化。结果　促胃液素能够增强Colo32 0和Colo32 0 /GR细胞侵袭力和FAKtyr -397磷酸化,具有剂量依赖性。促胃液素受体表达增加可以增强细胞的侵袭力和FAKtyr- 397磷酸化。使用FAK反义寡核苷酸对FAK的表达进行阻断后,促胃液素的作用明显下降。结论　促胃液素可有效地增强结肠癌细胞的侵袭力,其作用是通过促胃液素 促胃液素受体FAK通路实现的。 展开更多
关键词 细胞侵袭力 促胃液素 BOYDEN小室 反义寡核苷酸 蛋白质印迹法 人结肠癌细胞株 信号通路 真核表达载体 免疫沉淀 FAK 黏着斑激酶 剂量依赖性 磷酸化 递增剂量 正常细胞 受体表达 组细胞 GR 高表达 酪氨酸 转染 阻断 检测
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乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染 被引量：9
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作者 陈红英 唐南洪 +2 位作者 张生君 陈治新 王小众 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第3期614-617,共4页
目的:构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株. 方法:用PCR法扩增HBVX基因序列,将其添A后连至PUCmT载体上,用EcolⅠ和Hind Ⅲ双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体,连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X.用脂质体转染法将PcDNA3-X及... 目的:构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株. 方法:用PCR法扩增HBVX基因序列,将其添A后连至PUCmT载体上,用EcolⅠ和Hind Ⅲ双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体,连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X.用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中,G418选择培养,RT- PCR鉴定其稳定表达. 结果:已构建的PcDNA3-X经序列测定含有完整的HBV X 基因片段,转入HL-7702细胞后经RT-PCR证实该细胞有稳定表达X蛋白. 结论:成功构建了表达HBV X基因的肝细胞株,为进一步探讨HBV X基因在肝炎与肝癌发生中的作用提供了理想的实验模型. 展开更多
关键词 乙肝病毒 X基因 真核表达载体 HL-7702细胞株 脂质体转染法 肝癌
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