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一种高通量快速鉴定重组子方法的建立
1
作者 王亚男 黄培华 樊宝良 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第5期65-66,共2页
利用添加了RNaseA的1X cracking buffer直接裂解细菌增强观测效果,排除RNA干扰,通过琼脂糖凝胶电泳与空载体质粒进行比较,建立一种高通量快速鉴定重组子的方法。该方法方便易行,大大提高了工作效率。
关键词 CRACKING BUFFER 直接裂解 RNAseA 重组子鉴定 克隆鉴定 优化方法
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子宫内膜增生与子宫内膜癌 被引量：1
2
作者 邵兰芳 《甘肃科技纵横》 2008年第5期213-213,215,共2页
子宫内膜癌是原发于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,近年来发病率持续上升,常与接受雌激索、肥胖和子宫内膜增生有关,还和环境因素、吸烟、遗传因素有关,近年来有关子宫内膜癌的治疗方法与预后的研究有很大进展。
关键词 雌激素 子宫内膜增生 子宫内膜癌
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共表达TcRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建及其杀伤肝癌细胞作用的研究 被引量：2
3
作者 王俊伟 张巨峰 +3 位作者 张文峰 牟艳芳 邵红伟 黄树林 《现代生物医学进展》 CAS 2008年第11期2001-2004,共4页
目的:构建共表达TCRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体Ad.TCRα12.2-IRES-Vβ7.1,并研究其杀伤肝癌细胞的作用。方法:提取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,用RT-PCR的方法得到TCRα12-2基因。TCRVβ7.1基因... 目的:构建共表达TCRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体Ad.TCRα12.2-IRES-Vβ7.1,并研究其杀伤肝癌细胞的作用。方法:提取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,用RT-PCR的方法得到TCRα12-2基因。TCRVβ7.1基因由pCDN3.1-Vβ7.1扩增获得,将这两个基因以IRES相连克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中。穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1的重组腺病毒。然后提取病毒基因组DNA,对外源目的基因进行PCR鉴定;病毒感染宫颈癌细胞(HELA),48小时后提取细胞总RNA,通过RT-PCR鉴定目的基因表达;最后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达。对鉴定正确的病毒进行大量扩增并测定滴度。用MTT比色法检测Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞HEPG2和BEL-7402的杀伤作用。结果:从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,RT-PCR和流式细胞仪检测表明目的基因可以有效的表达。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于PBMC组和Ad-GFP感染组。结论:成功构建了双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,且其感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞。 展开更多
关键词 TCR 重组腺病毒栽体 TCRα12-2 TCRVβ7.1
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HDAC2 cDNA的克隆及在酵母细胞中的表达
4
作者 陈坚 张晓琴 傅继梁 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2000年第3期129-132,共4页
目的 :本研究的目的为获得HDAC2的cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因。方法 :利用RT -PCR方法 ,从人HeLa细胞中扩增出一约 1 5Kb的DNA片段 ,全自动测序后 ,重组入pLexA载体 ,构建成 pLexA -HDAC2 ,用醋酸锂法转化酵母菌EGY48(p8op -l... 目的 :本研究的目的为获得HDAC2的cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因。方法 :利用RT -PCR方法 ,从人HeLa细胞中扩增出一约 1 5Kb的DNA片段 ,全自动测序后 ,重组入pLexA载体 ,构建成 pLexA -HDAC2 ,用醋酸锂法转化酵母菌EGY48(p8op -lacZ)。 结果 :结果显示 ,获得的 1 .5Kb的DNA片段碱基序列与文献报道的HDAC2的cDNA一致。pLex A -HDAC2转化EGY48(p8op -LacZ) 3天后 ,长出 1mm大小的白色菌落。 结论 :上述结果表明 pLexA -HDAC2可在EGY48(p8op -LacZ)稳定表达 ,无毒性 ,也没有自身激活LacZ的功能 ,可作为酵母双杂交系统中的靶基因。 展开更多
关键词 酵母双杂交系统 HDAC2 CDNA 表达
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林可霉素生物合成基因lmbU的敲除及其遗传回补 被引量：3
5
作者 吕彩霞 杨捷 +2 位作者 叶江 吴海珍 张惠展 《华东理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第1期60-65,共6页
利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensisNRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensisJLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力。利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成... 利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensisNRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensisJLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力。利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成能力。单一回补下游基因lmbY和lmbX不能使缺陷株重新恢复林可霉素合成能力;而同时回补lmbU基因和下游基因lmbY和lmbX却能回补这种缺陷,缺陷株林可霉素合成能力的丧失不仅是由下游基因的破坏而引起,证实了lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因。根据不同重组质粒上装载的基因片段性质推测了lmbU基因可能的启动子。 展开更多
关键词 同源重组 敲除 遗传回补 林可霉素生物合成
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分子生物学实验课程自主实验设计教学改革探讨 被引量：2
6
作者 范亚军 郑梅竹 +1 位作者 宋相伟 章有知 《长春师范大学学报》 2020年第4期163-164,共2页
分子生物学实验是锻炼本科学生掌握并运用相关实验技术的有效途径,本文就分子生物学实验课程改革及授课方式对学生实践能力的作用进行了分析探讨,教学效果表明改革后的课程体系能更好地提高学生动手及解决实际问题的能力,实践结果可为... 分子生物学实验是锻炼本科学生掌握并运用相关实验技术的有效途径,本文就分子生物学实验课程改革及授课方式对学生实践能力的作用进行了分析探讨,教学效果表明改革后的课程体系能更好地提高学生动手及解决实际问题的能力,实践结果可为进一步的课程改革提供研究基础。 展开更多
关键词 分子生物学 实验教学改革 实践能力
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黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法 被引量：1
7
作者 聂鑫怡 薛杨 +2 位作者 王银春 丁霞飞 汪世华 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第2期270-275,共6页
为解决黄曲霉遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限及传统URA3/pyrG环出系统存在重复序列残留的问题,以具有尿嘧啶营养缺陷的黄曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株为出发菌,利用pyrG筛选标记构建表达HA-SumO的重组菌株GHS(pyrG+),再通过重叠... 为解决黄曲霉遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限及传统URA3/pyrG环出系统存在重复序列残留的问题,以具有尿嘧啶营养缺陷的黄曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株为出发菌,利用pyrG筛选标记构建表达HA-SumO的重组菌株GHS(pyrG+),再通过重叠PCR法构建包含GHS(pyrG+)基因组中pyrG整合位点上、下游片段的融合片段,导入GHS(pyrG+)菌株原生质体,利用DNA同源重组和5-氟乳清酸(5-FOA)的负筛选剔除pyrG筛选标记,重新获得具有尿嘧啶营养缺陷的重组菌株GHS(pyrG-).通过测序分析,确认GHS(pyrG-)重组菌株基因组中的pyrG筛选标记已被剔除且无其他序列残留.免疫杂交分析结果表明,剔除pyrG筛选标记不影响重组菌株的蛋白表达模式. 展开更多
关键词 pyrG遗传筛选标记 循环利用 不依赖同向重复序列 黄曲霉
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大鼠肾皮质受体相关蛋白克隆基因重组表达质粒的构建及分子生物学鉴定 被引量：1
8
作者 胡迎青 张卫苏 《南通医学院学报》 1998年第2期145-146,共2页
运用ＤＮＡ重组技术，将用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白３１９个氨基酸的核苷酸序列导入载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和表达载体ｐＧＥＸ中，分别构建了重组质粒ｐＢＳＫ９ＲＡＰ和ｐＧＥＸ－９ＲＨ７，转化入大肠杆菌... 运用ＤＮＡ重组技术，将用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白３１９个氨基酸的核苷酸序列导入载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和表达载体ｐＧＥＸ中，分别构建了重组质粒ｐＢＳＫ９ＲＡＰ和ｐＧＥＸ－９ＲＨ７，转化入大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ和ＤＨ５α中，经ＩＰＴＧ、ｘ－ｇａｌ和抗生素筛选阳性克隆，扩增后，重组质粒用限制性内切酶图谱分析及ＤＮＡ测序分析，证明插入子插入方向正确，表达阅读框架正确。 展开更多
关键词 质粒 受体相关蛋白 肾皮质 基因重组
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GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达 被引量：1
9
作者 邢俊平 杨宇 +2 位作者 王全颖 杨广笑 邱曙东 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期316-319,共4页
目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此... 目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 报告基因 表达
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高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI^+的表达纯化
10
作者 丁莉莉 魏锐利 +1 位作者 蔡季平 李由 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1324-1328,共5页
目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI^+。为进一步研究其活性奠定基础。方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI^+,将PCR产物克隆至pGEM- T载体中,经酶切及测序鉴定... 目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI^+。为进一步研究其活性奠定基础。方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI^+,将PCR产物克隆至pGEM- T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a(+)重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI^+,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物。结果:成功扩增融合基因VEGI^+,构建的重组质粒pET30a-VEGI^+酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主。SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI^+相对分子质量约为23000,纯度约为90%。结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI^+。 展开更多
关键词 血管内皮生长抑制因子 寡肽类 基因融合
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枯草芽孢杆菌草酸脱羧酶转化拟南芥研究初报 被引量：2
11
作者 陈晓婷 陈芳芳 +4 位作者 郑麟 林志伟 王爱荣 鲁国东 王宗华 《中国农学通报》 CSCD 2008年第2期53-58,共6页
多种真菌在致病过程中会分泌草酸,这些草酸产生菌寄主范围广,可以导致上百种植物病害,造成世界范围农作物的严重减产。草酸可以通过氧化与脱羧两种途径降解。该研究克隆了枯草芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因Yvrk,并构建其植物表达载体,通过... 多种真菌在致病过程中会分泌草酸,这些草酸产生菌寄主范围广,可以导致上百种植物病害,造成世界范围农作物的严重减产。草酸可以通过氧化与脱羧两种途径降解。该研究克隆了枯草芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因Yvrk,并构建其植物表达载体,通过农杆菌浸花转化拟南芥,收获种子,用除草剂Basta筛选获得15株转基因植株,对其中的11个株系分别离体接种菌核病菌,24h后量病斑,发现有6株转基因植株的病斑显著小于野生型。PCR验证发现大部分转基因植株确有Yvrk的存在,实验结果说明草酸脱羧酶基因确能一定程度上缓解真菌病害。 展开更多
关键词 拟南芥 枯草芽孢杆菌 草酸脱羧酶 菌核病菌
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东亚飞蝗pSMC重组抗原表达及多克隆抗体制备 被引量：1
12
作者 王麒霖 邱佳 +1 位作者 余瑛 夏玉先 《重庆理工大学学报（自然科学）》 CAS 北大核心 2021年第10期257-263,共7页
采用生物信息学方法对pSMC抗原特性进行分析;利用DNA重组技术构建pSMC_(249-383)重组表达菌株;以Ni亲和层析技术纯化重组pSMC_(249-383)蛋白;用重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠,制备Anti-pSMC多克隆抗体;采用免疫荧光法检测pSMC在血细... 采用生物信息学方法对pSMC抗原特性进行分析;利用DNA重组技术构建pSMC_(249-383)重组表达菌株;以Ni亲和层析技术纯化重组pSMC_(249-383)蛋白;用重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠,制备Anti-pSMC多克隆抗体;采用免疫荧光法检测pSMC在血细胞中的定位。将pSMC编码区249-383区段插入pET30a(+),成功构建了pSMC_(249-383)原核表达菌株;用表达、纯化获得的重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠成功获得了高效价的Anti-pSMC多克隆抗体;免疫荧光检测显示pSMC在东亚飞蝗血淋巴吞噬细胞高表达,定位于细胞核,为研究pSMC功能奠定了基础。 展开更多
关键词 东亚飞蝗 染色体结构维持蛋白 DNA重组 生物信息学 多克隆抗体
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原生质体紫外诱变选育竹红菌甲素高产菌株 被引量：4
13
作者 潘魏松 嵇源源 +1 位作者 杨珠英 王剑文 《生物加工过程》 CAS CSCD 2012年第6期18-23,共6页
采用原生质体紫外诱变技术选育竹红菌甲素高产菌株。结果表明:以竹黄菌Shiraia sp.S8为出发菌株,当使用混合酶系(5 mg/mL纤维素酶和10 mg/mL蜗牛酶)在30℃处理菌丝2 h,获得菌丝原生质体3.24×106个/mL。以竹黄菌原生质体在距离15 W... 采用原生质体紫外诱变技术选育竹红菌甲素高产菌株。结果表明:以竹黄菌Shiraia sp.S8为出发菌株,当使用混合酶系(5 mg/mL纤维素酶和10 mg/mL蜗牛酶)在30℃处理菌丝2 h,获得菌丝原生质体3.24×106个/mL。以竹黄菌原生质体在距离15 W紫外灯30 cm处照射诱导,获得诱变菌株C6。其竹红菌甲素产量达到28.1 mg/L,比原始出发菌株提高了53.7%,且遗传稳定,具有较高的医药与工业应用价值。 展开更多
关键词 竹黄菌 原生质体诱变 竹红菌素 选育
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一种简便快速筛选重组子的方法 被引量：6
14
作者 崔锦 李林珂 马向东 《生物技术》 CAS CSCD 2005年第6期46-47,共2页
目的:根据碱裂解法抽提质粒DNA的原理,研究应用快检缓冲液方法挑取重组子克隆,从而获得简单易行,快速方便,节省时间,提高工作效率的筛选重组子的方法。方法:不需抽提质粒,只要将菌落接入快检缓冲液后直接进行普通琼脂凝胶电泳分析,就可... 目的:根据碱裂解法抽提质粒DNA的原理,研究应用快检缓冲液方法挑取重组子克隆,从而获得简单易行,快速方便,节省时间,提高工作效率的筛选重组子的方法。方法:不需抽提质粒,只要将菌落接入快检缓冲液后直接进行普通琼脂凝胶电泳分析,就可以快速筛选出重组子。结果:结果和提取质粒酶切鉴定结果一致。结论:经实验证明用快检缓冲液方法筛选重组子是一种简单易行,快速方便,节省时间,提高工作效率并且可靠的方法。 展开更多
关键词 快速 简便 重组子 筛选
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白细胞介素2受体α链基因的体外转录研究
15
作者 沈珝琲 侯忠诚 +4 位作者 莽锐 吴宁华 强伯勤 郑重 刘永明 《自然科学进展（国家重点实验室通讯）》 1994年第5期619-624,共6页
白细胞介素2受体(IL2R)由α,β和γ链所组成,其中γ链不直接与IL2结合,它与组成性表达的β链一起主要参与信号的内传,因此α链的表达成为高亲合力受体是否存在的关键。IL2Rα基因的启动子区包含-58bp和+1bp两个主要转录起始点及它们的上... 白细胞介素2受体(IL2R)由α,β和γ链所组成,其中γ链不直接与IL2结合,它与组成性表达的β链一起主要参与信号的内传,因此α链的表达成为高亲合力受体是否存在的关键。IL2Rα基因的启动子区包含-58bp和+1bp两个主要转录起始点及它们的上游-90bp和-30bp处的两个TATA盒; 展开更多
关键词 白细胞介素2 基因转录 体外 链
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重组家蚕核型多角体病毒表达乙肝病毒S区抗原
16
作者 李晓宇 耿毅 +2 位作者 郑菊梅 张耀洲 刘栓桃 《微生物学免疫学进展》 1998年第2期6-10,共5页
报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｒ亚型）Ｓ区基因（共６８１ｎｔ）克隆于家蚕核型多角体病毒的基因组中，并将其导入家蚕细胞，通过多轮筛选得到纯的重组家蚕杆状病毒，用该病毒接种家蚕，初步证明能够得到乙肝表面抗原的高效表达，在家蚕... 报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｒ亚型）Ｓ区基因（共６８１ｎｔ）克隆于家蚕核型多角体病毒的基因组中，并将其导入家蚕细胞，通过多轮筛选得到纯的重组家蚕杆状病毒，用该病毒接种家蚕，初步证明能够得到乙肝表面抗原的高效表达，在家蚕幼虫的血淋巴和蛹体中其用ＰＲＨＡ法检测的滴度可达１∶４０９６。 展开更多
关键词 表面抗原 家蚕 核型多角体病毒 乙型肝炎 重组
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水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究 被引量：4
17
作者 昝云红 孙茂盛 +1 位作者 郭仁 代长柏 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期361-366,共6页
目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达，以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择酿酒酵母偏爱的密码子，设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２... 目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达，以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择酿酒酵母偏爱的密码子，设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段，进行人工合成，并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后，将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连，并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ，经鉴定表明，获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中，检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。 展开更多
关键词 水蛭素 基因合成 酿酒酵母
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血管紧张素Ⅱ2型受体基因重组腺病毒简便快速的构建方法 被引量：3
18
作者 唐兵 黎军 +1 位作者 何国祥 李德 《医学研究生学报》 CAS 2005年第5期402-403,407,F003,共4页
目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目... 目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目的基因的重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad AT2R。用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有GFP报告基因,对病毒滴度进行监测。结果:PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因AT2R,滴度为1.5×1012pfu/ml。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒比传统的细胞内同源重组法具有成功率高、方法简便、快捷和实验周期短的优点。AT2R基因重组腺病毒的成功构建为进一步实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 腺病毒 血管紧张素Ⅱ2型受体基因 同源重组 细菌
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沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证 被引量：2
19
作者 梁睿 康权 +5 位作者 谭俊杰 赵利华 索涛莉 孙艳辉 金先庆 罗庆 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期194-198,共5页
目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证。方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质... 目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证。方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用PacI酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度。用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)及Western印迹法验证其沉默效果。结果:PacI酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×1010pfu/mL。感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%。结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 腺病毒科感染 DNA 重组 RNA干扰 基因 CTGF 细胞 4T1
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大片段两步同源重组敲除节杆菌肌酐酸脱氢酶基因质粒的构建 被引量：1
20
作者 童鹏 李楠 +3 位作者 牛欢青 柳东 郭亭 应汉杰 《生物加工过程》 CAS 2016年第1期14-18,35,共6页
构建一种新型的含有大片段同源臂的重组质粒用来对节杆菌进行代谢工程的改造。使用PCR扩增线性化载体片段,并通过酶切获取同源重组大片段,利用一步克隆技术将上述两片段连接起来;通过PCR-targeting将目标基因替换,并利用酶切自连将插入... 构建一种新型的含有大片段同源臂的重组质粒用来对节杆菌进行代谢工程的改造。使用PCR扩增线性化载体片段,并通过酶切获取同源重组大片段,利用一步克隆技术将上述两片段连接起来;通过PCR-targeting将目标基因替换,并利用酶切自连将插入的片段删除,最后成功得到目标质粒p UK-d IMP。构建的质粒通过2次同源重组将目的基因肌酐酸脱氢酶(IMPDH)成功敲除,且最后菌株不含有任何抗性,开辟了一种针对节杆菌而言新型的基因改造方法。其中IMPDH基因缺失的菌株积累目标产物环磷酸腺苷的能力比对照菌株高49.7%,达到了(9.01±0.20)g/L。 展开更多
关键词 节杆菌 环磷酸腺苷 同源重组 基因敲除
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