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3种检测吡咯喹啉醌的方法比较 被引量：17
1
作者 杨延新 熊向华 +1 位作者 游松 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2011年第4期544-547,共4页
目的:研究和比较3种检测吡咯喹啉醌(PQQ)的方法,确定各种方法的特点和适用范围。方法:设计和改进了3种检测PQQ的方法,分别为活性电泳法、光谱法和NBT-Gly法,探讨其检测限和线性范围、精密度、样品检测和加样回收率。结果:活性电泳法专... 目的:研究和比较3种检测吡咯喹啉醌(PQQ)的方法,确定各种方法的特点和适用范围。方法:设计和改进了3种检测PQQ的方法,分别为活性电泳法、光谱法和NBT-Gly法,探讨其检测限和线性范围、精密度、样品检测和加样回收率。结果:活性电泳法专一性好,具有很高的灵敏度,可检测到12.6 ng/mL PQQ,可靠但准确性较差;NBT-Gly法操作简便,可用于大量样品的检测,但重复性不佳;光谱法精密度较好,但样品中存在吸光物质时对检测结果影响较大。结论:活性电泳法、光谱法和NBT-Gly法均可用于PQQ的检测,活性电泳法适于培养上清等复杂样品的粗略定量,NBT-Gly法适于大量样品的检测,光谱法适于纯度较高的PQQ的定量。 展开更多
关键词 吡咯喹啉醌 检测方法 活性电泳法 光谱法 NBT-Gly法
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2种太岁样品中微生物的分离和鉴定 被引量：16
2
作者 林涧 熊向华 +3 位作者 葛欣 汪建华 苏昕 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2013年第6期825-827,共3页
目的:太岁是自然界中一种组成及分类尚不明确的生物体。采用分子生物学方法对2种不同来源地的太岁样品进行菌种分离培养和分子鉴定。方法:太岁表面经75%乙醇消毒处理后,用麦芽汁培养基分离可培养菌株,提取太岁及分离菌株基因组DNA,以之... 目的:太岁是自然界中一种组成及分类尚不明确的生物体。采用分子生物学方法对2种不同来源地的太岁样品进行菌种分离培养和分子鉴定。方法:太岁表面经75%乙醇消毒处理后,用麦芽汁培养基分离可培养菌株,提取太岁及分离菌株基因组DNA,以之为模板,用16S rDNA、18S rDNA和ITS通用引物进行PCR扩增,扩增片段连入pMD18T载体并测序,通过序列比对对太岁菌种组成进行初步鉴定。结果:从太岁1号样品中分离到假丝酵母(Can?dida)和粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),从太岁2号样品中分离到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和粘质红酵母。结论:2种来源不同的太岁样品中均存在可培养的粘质红酵母。 展开更多
关键词 太岁 生物多样性 培养 分子鉴定
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吡咯喹啉醌研究进展 被引量：11
3
作者 杨璐 熊向华 +1 位作者 汪建华 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2009年第6期874-879,共6页
吡咯喹啉醌(PQQ)是继烟酰胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶,具有多种生理功能,在食品、医药及农业等行业有广泛的应用前景。我们简要综述了PQQ参与醌酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应能力、促进植物生长、刺激神... 吡咯喹啉醌(PQQ)是继烟酰胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶,具有多种生理功能,在食品、医药及农业等行业有广泛的应用前景。我们简要综述了PQQ参与醌酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应能力、促进植物生长、刺激神经生长因子生成等生物学功能及相关作用机制,介绍了PQQ生产菌、PQQ合成基因及PQQ生物合成的调控等方面的研究进展。 展开更多
关键词 吡咯喹啉醌 生理功能 辅酶 生物合成基因
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人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定 被引量：7
4
作者 赵洪亮 薛冲 +3 位作者 熊向华 张伟 杨秉芬 刘志敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期254-258,共5页
为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HSA)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HSA AX15 (R13K)。HSA AX15 (R13K)融合蛋白基因... 为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HSA)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HSA AX15 (R13K)。HSA AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HSA融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HSA AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg kg的HSA AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HSA AX15 (R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。 展开更多
关键词 睫状神经营养因子 巴斯德毕赤酵母 长效蛋白药物
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二硫键异构酶 被引量：7
5
作者 熊向华 刘志敏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第B04期176-179,共4页
天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质 活性方面起重要作用。讨论的二硫键异构酶是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋 白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白... 天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质 活性方面起重要作用。讨论的二硫键异构酶是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋 白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。PDI 广泛应用于基因工程上提高外源蛋白表达水平。 展开更多
关键词 二硫键异构酶 蛋白折叠 蛋白聚集 分子伴侣
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新型载体蛋白P64K在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化 被引量：3
6
作者 熊向华 赵洪亮 +3 位作者 薛冲 张伟 杨秉芬 刘志敏 《生物技术通讯》 CAS 2004年第3期231-234,共4页
用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21穴DE3雪宿主菌,经IPTG诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30%。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G20... 用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21穴DE3雪宿主菌,经IPTG诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30%。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G200分子筛柱和Q阴离子柱三步层析后纯度达到95%以上,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。 展开更多
关键词 载体蛋白 P64K 大肠杆菌 可溶性表达 纯化 重组质粒
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甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究 被引量：6
7
作者 李大攀 葛欣 +4 位作者 魏静远 熊向华 汪建华 杨秀萍 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2014年第5期632-635,共4页
目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR... 目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。 展开更多
关键词 甲基营养菌 甲醇脱氢酶 基因敲除 吡咯喹啉醌
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“智三针”电针刺激对老年髋关节置换术后认知功能的影响 被引量：6
8
作者 谢飞林 徐洲发 熊向华 《广州中医药大学学报》 CAS 2016年第6期813-817,共5页
【目的】探讨"智三针"电针刺激对老年髋关节置换术后认知功能的影响。【方法】纳入择期行全髋关节置换术老年患者120例,按手术时间随机分为电针治疗组(治疗组)和对照组,每组60例。对照组给予术后临床常规治疗,治疗组在对照组... 【目的】探讨"智三针"电针刺激对老年髋关节置换术后认知功能的影响。【方法】纳入择期行全髋关节置换术老年患者120例,按手术时间随机分为电针治疗组(治疗组)和对照组,每组60例。对照组给予术后临床常规治疗,治疗组在对照组术后临床常规治疗的基础上,于术毕前30 min及术后第1、2天行"智三针"电针刺激疗法。记录2组麻醉停止后自主呼吸恢复时间、唤之睁眼时间、意识完全恢复时间、拔管时间及苏醒评分(Steward评分)情况;采用认知功能恢复质量量表(PQRS)评估2组患者术后第1、2、3、5、7天的认知功能评分,并统计术毕第1、2、3、5、7天认知功能障碍(POCD)发生率。【结果】(1)治疗组唤之睁眼时间、意识完全恢复时间、拔管时间均较对照组缩短(P<0.01),苏醒评分(Steward评分)也显著高于对照组(P<0.01)。(2)术毕第1、2、3、5、7天,治疗组术后PQRS量表评分均明显高于对照组(P<0.01)。(3)术后第1、2、3、5、7天,治疗组的POCD发生率均低于对照组,除术后第7天外,其余各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。【结论】"智三针"电针刺激能改善和提高老年髋关节置换术后认知功能,其术后认知功能障碍的发生率较低。 展开更多
关键词 智三针 电针 老年 髋关节置换术 认知功能
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高效液相色谱法分析吡咯喹啉醌 被引量：5
9
作者 魏静远 李大攀 +6 位作者 赵炜楠 葛欣 毕波 熊向华 汪建华 杨秀萍 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2015年第2期241-244,共4页
目的：建立一种通过高效液相色谱（HPLC）定量测定吡咯喹啉醌（PQQ）的分析方法。方法：将PQQ标准品及发酵制备的PQQ结晶粉末溶于10 mmol/L NaOH溶液，利用高效液相色谱仪进行测定。采用Waters XBridge C18（4.6 mmx150 mm，5μm）作为... 目的：建立一种通过高效液相色谱（HPLC）定量测定吡咯喹啉醌（PQQ）的分析方法。方法：将PQQ标准品及发酵制备的PQQ结晶粉末溶于10 mmol/L NaOH溶液，利用高效液相色谱仪进行测定。采用Waters XBridge C18（4.6 mmx150 mm，5μm）作为分离柱，用甲醇-水（用三氟乙酸调节pH值为1.0）梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，于室温下检测PQQ，检测波长为365.8 nm。结果：检测得PQQ标准品的保留时间约为7.8 min，在0.03125-1 mg/mL范围内线性关系良好，相关系数（r2）在0.9999以上，平均回收率为98.6%。结论：高效液相色谱法分析PQQ的灵敏度和准确度高，是一种可靠的PQQ定量分析方法。 展开更多
关键词 高效液相色谱 吡咯喹啉醌 分析方法
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A型肉毒毒素内肽酶免疫检测方法的建立 被引量：5
10
作者 安佳佳 付楚溪 +2 位作者 汪建华 熊向华 张惟材 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第9期659-663,共5页
目的建立一种A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。方法首先构建参考底物蛋白SNAP251-197质粒并表达纯化,合成检测目标8肽序列且于兔体内制备并纯化其抗体;96孔板包被底物蛋白,利用ELISA方法建立A型肉毒毒素生物活性定量检测体系,... 目的建立一种A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。方法首先构建参考底物蛋白SNAP251-197质粒并表达纯化,合成检测目标8肽序列且于兔体内制备并纯化其抗体;96孔板包被底物蛋白,利用ELISA方法建立A型肉毒毒素生物活性定量检测体系,并对检测方法的检测限、重复性及精密度等因素进行评价。结果成功表达纯化了SNAP251-197底物蛋白,制备并纯化了8肽兔多抗,建立了BoNT/A ELISA检测体系。结论成功建立了一种简便、灵敏、快速、稳定、可靠的A型肉毒毒素内肽酶生物活性定量检测方法。 展开更多
关键词 突触小体相关蛋白25 肉毒杆菌毒素类 A型 内肽酶类 酶联免疫吸附测定 免疫检测方法
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A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测 被引量：4
11
作者 赵鹏 胡颖 +5 位作者 安佳佳 韦娜 熊向华 汪建华 张惟材 徐威 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期396-400,共5页
目的从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(Bo NT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成Bo NT/A LC序列,克隆至p TIG质粒,转化BL21(DE3)plys S感受态细胞,IPT... 目的从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(Bo NT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成Bo NT/A LC序列,克隆至p TIG质粒,转化BL21(DE3)plys S感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经"吸附-洗脱-扩增"程序淘选富集抗体并进行特异性筛选。PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性。结果可溶性表达的Bo NT/A LC占全菌蛋白的36.8%,纯化后蛋白纯度达99%。从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合Bo NT/A LC蛋白。结论该研究得到了两株特异性的Bo NT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗。 展开更多
关键词 A型肉毒神经毒素 噬菌体抗体库 抗体 单克隆
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抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：4
12
作者 赵巧林 陆璐 +4 位作者 毕波 景爱霞 汪建华 张惟材 熊向华 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期322-325,共4页
目的制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端(heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A,Bo NT/AHc)特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化Bo NT/AHc抗原、免疫BALB/c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体... 目的制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端(heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A,Bo NT/AHc)特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化Bo NT/AHc抗原、免疫BALB/c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与Bo NT/AHc突变体结合,初步鉴定其在Bo NT/AHc的结合表位。结果得到纯度较高的Bo NT/AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均>3.0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与Bo NT/AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于Ig G1(Κ),3H3属于Ig M(Κ),而5H8属于Ig G2b(Κ);叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与Bo NT/AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与Bo NT/AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。 展开更多
关键词 肉毒杆菌毒素 A型 重链 抗体 单克隆 中和抗体 突变体 表位
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蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达 被引量：3
13
作者 赵洪亮 薛冲 +3 位作者 熊向华 张伟 朱厚础 刘志敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期394-397,共4页
AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由 12和 13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶... AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由 12和 13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK ,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15 (R13K)。AX15 (R13K)的稳定性得到了显著的提高 ,在诱导 10 0h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度 >90 %的AX15 (R13K)。TF 1细胞存活实验表明AX15 (R13K)具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性 ,在临床应用上具有潜在的优势。 展开更多
关键词 睫状神经营养因子 巴斯德毕赤酵母 蛋白酶抗性
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甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达 被引量：4
14
作者 李淼鑫 熊向华 +2 位作者 汪建华 刘党生 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2010年第6期779-782,共4页
目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化... 目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。 展开更多
关键词 甲基营养菌 甲醇脱氢酶 接合转移 吡咯喹啉醌
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甲基营养菌MP688葡萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究 被引量：4
15
作者 王文溪 葛欣 +4 位作者 韩月梅 熊向华 汪建华 张景海 张惟材 《生物技术通讯》 CAS 2013年第6期805-809,共5页
目的:鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法:对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计引物扩增mpq_2164和缺失跨... 目的:鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法:对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计引物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载体pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果:分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ_2164的氨基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ_2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论:MPQ_2164是一个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源表达。 展开更多
关键词 葡糖糖脱氢酶 甲基营养菌 表达纯化 吡咯喹啉醌
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多形汉逊酵母研究进展 被引量：4
16
作者 熊向华 刘志敏 陈惠鹏 《生物技术通讯》 CAS 2006年第5期771-774,共4页
作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物,多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视。在工程应用领域,利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势。譬如容易得到高拷贝,在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋... 作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物,多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视。在工程应用领域,利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势。譬如容易得到高拷贝,在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋白等。已有多种外源蛋白在多形汉逊酵母系统中得到表达。本文综述了多形汉逊酵母的基本生物学性质、基础研究领域概况及其在外源基因表达方面的特点和进展。 展开更多
关键词 多形汉逊酵母 甲醇氧化酶 过氧化物酶体 外源基因表达
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生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达 被引量：4
17
作者 王楠 赵洪亮 +3 位作者 刘志敏 刘党生 薛冲 熊向华 《生物技术通讯》 CAS 2007年第4期574-577,共4页
目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全... 目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。 展开更多
关键词 生长激素释放激素 人血清白蛋白 毕赤酵母 表达 生物学活性
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口服表达尿酸氧化酶的乳酸乳球菌调控小鼠血尿酸水平
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作者 程昊 熊国庆 +7 位作者 崔佳珍 陈志励 朱晨 宋娜 王庆阳 熊向华 刘刚 陈惠鹏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4111-4119,共9页
尿酸氧化酶(urate oxidase,Uox)是尿酸代谢的关键酶,已经用于人高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)的治疗。然而,异源性尿酸氧化酶进入血液会引发免疫排斥反应产生抗体,影响疗效。本研究采用食品级益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9... 尿酸氧化酶(urate oxidase,Uox)是尿酸代谢的关键酶,已经用于人高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)的治疗。然而,异源性尿酸氧化酶进入血液会引发免疫排斥反应产生抗体,影响疗效。本研究采用食品级益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000为底盘细胞,构建了表达黄曲霉源尿酸氧化酶的工程菌(NZ9000-aUox)和“恢复”活性的人源尿酸氧化酶的工程菌(NZ9000-hUox)。结果表明,表达外源尿酸氧化酶的工程菌可在体外降低尿酸,并具有时间依赖性。进一步利用酵母膏成功诱导小鼠血尿酸升高,在第7天和第14天灌胃给予酵母膏的小鼠血尿酸均值分别升高85.4%和106.2%;同时工程菌NZ9000-aUox给药组小鼠血尿酸仅分别升高39.5%和48.3%,NZ9000-hUox给药组小鼠血尿酸分别升高57.0%和82.9%,证明工程菌能明显抑制血尿酸的升高。将效果更加显著的工程菌NZ9000-aUox与高尿酸血症一线治疗药物别嘌醇进行安全性比较,结果显示工程菌的肝脏安全性与别嘌醇相当,肾脏安全性优于别嘌醇,不仅能够缓解血尿酸升高导致的肾损伤,还能够避免别嘌醇治疗过程中可能引发的肾损伤加重的风险。本研究为高尿酸血症的长期治疗和调控提供了一种有效并且更加安全的治疗方法。 展开更多
关键词 尿酸氧化酶 乳酸乳球菌 高尿酸血症模型小鼠 高尿酸血症 安全性
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基于Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络优化吡咯喹啉醌合成 被引量：4
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作者 寇航 王艳梅 +4 位作者 李彤 薄明井 张惟材 熊向华 黎明 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期173-183,共11页
通过构建Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络模型(genome scale of metabolic network model,GSMM),发掘能够提升吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)产量的发酵策略和相关靶基因。基于其注释的基因组和生化信息,构建J1-1的G... 通过构建Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络模型(genome scale of metabolic network model,GSMM),发掘能够提升吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)产量的发酵策略和相关靶基因。基于其注释的基因组和生化信息,构建J1-1的GSMM。再通过COBRApy预测可能使PQQ产量提高的氨基酸和潜在的靶基因并进行验证。构建了Methylovorus sp.J1-1的GSMM模型iKH584,共有584个基因,779个生化反应,121个交换反应与765个代谢产物,且可以用于后续模拟。根据iKH584模拟,外源添加谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸、过表达glyA与hps1以及敲除hps2基因,均具有促进PQQ合成效果。结果表明:添加谷氨酸与脯氨酸时,PQQ的产量分别提高了10.4%与22.9%;过表达基因glyA与hps1,PQQ产量分别提高20.6%与14.6%;敲除基因hps2,PQQ产量最高可达140.84 mg/L,提高了8.0%,这与模拟结果基本一致,表明构建的模型基本正确。最后,在5 L发酵罐进行J1-1△hps2的分批补料发酵,PQQ的产量为812.64 mg/L,比亲本菌株提高了11.1%。建立的模型可以用来指导J1-1的发酵和菌株改造,提高PQQ产量。 展开更多
关键词 Methylovorus sp.J1-1 基因组尺度代谢网络模型 吡咯喹啉醌 氨基酸 靶基因预测
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一株吡咯喹啉醌产生菌的筛选和初步鉴定 被引量：4
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作者 杨亚欣 刘天 +5 位作者 李彤 孙晓宇 汪建华 熊向华 张惟材 葛欣 《生物技术通讯》 CAS 2018年第5期609-612,624,共5页
目的:筛选新的吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌株。方法:收集土壤样品富集培养,分离菌株,NBT染色法快速筛选PQQ产生菌,经Native-PAGE复筛,NBT-Gly法和分光光度法相结合测定菌株PQQ产量;选取产量最高的1株菌考察菌株生长条件,扩增16S rDNA并测序,B... 目的:筛选新的吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌株。方法:收集土壤样品富集培养,分离菌株,NBT染色法快速筛选PQQ产生菌,经Native-PAGE复筛,NBT-Gly法和分光光度法相结合测定菌株PQQ产量;选取产量最高的1株菌考察菌株生长条件,扩增16S rDNA并测序,Blast比对分析确定菌株分类位置。结果:从500余份土壤样品中筛选得到1株PQQ产生菌T28,PQQ产量达13.3 mg/L。该菌株16S rDNA序列与生丝微菌的同源性为96%,确定了T28的最适生长培养基配方。结论:从土壤中筛选到1株新的PQQ产生菌,命名为生丝微菌T28。 展开更多
关键词 吡咯喹啉醌 筛选 鉴定 生丝微菌
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